Rozwikłano zagadkę struktury białka związanego z procesem widzenia

Białka są podstawowymi biomolekułami, które pełnią ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Są podstawowym budulcem komórek, tkanek i narządów uczestniczących w wielu procesach, od podstawowych mechanizmów na poziomie komórkowym, takich jak replikacja DNA, po złożone funkcje fizjologiczne, w tym te związane z procesem widzenia. Białka biorą udział w wykrywaniu światła, biosyntezie fotoczułych pigmentów w komórkach fotoreceptorów i wewnątrzkomórkowym przekazywaniu sygnału. Dysfunkcje lub wszelkiego rodzaju mutacje w tych białkach mogą zakłócać normalny proces widzenia i prowadzić do różnych chorób związanych z narządem wzroku. Niedawno naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk - Międzynarodowego Centrum Badań Oka (ICTER) opisali strukturę białka RBP3, polepszając zrozumienie procesu widzenia i jego powiązania z chorobami oczu.

Nasz naturalny detektor optyczny - oko - jest fascynującym i złożonym narządem, który pomaga nam widzieć otaczający świat. Prawidłowe funkcjonowanie tego niesamowitego organu wymaga zaangażowania wielu różnych cząsteczek. Widzenie rozpoczyna się w siatkówce, która jest cienką warstwą tkanki pokrywającą tylną część gałki ocznej. Działa ona jako platforma dla wielu maleńkich czopków i pręcików, które wychwytują światło fotoczułymi detektorami zwanymi fotoreceptorami. Fotoreceptory przekształcają światło w sygnały elektryczne, które są wysyłane do mózgu za pośrednictwem układu nerwowego w celu zinterpretowania ich jako obrazu. Działanie fotoreceptorów opiera się na specyficznej cząsteczce 11-cis-retinalu (11c-RAL), molekule pochłaniającej światło, która wiąże się z białkami opsyny (takimi jak rodopsyna), które inicjują proces widzenia poprzez przekształcanie światła w sygnały elektryczne. Kiedy fotony są absorbowane, kaskada reakcji chemicznych, w tym izomeryzacja 11-cis-retinalu (11cRAL) do all-trans-retinalu, inicjuje widzenie. Aby umożliwić ciągłe widzenie, 11cRAL musi być stale regenerowany. Tutaj zaczyna się historia białka RBP3...

 Molekuła RBP3 jest to białko wiążące retinol 3 (RBP3)zlokalizowane w strukturze międzykomórkowej, które odpowiada za prawidłowe funkcjonowanie cyklu wzrokowego. RBP3 działa jako transporter retinoidów między fotoreceptorami a komórkami nabłonka pigmentu siatkówki, a także wiąże niektóre ważne kwasy tłuszczowe. Białko RBP3 transportuje kluczowe cząsteczki, dzięki czemu pigmenty wzrokowe są gotowe do wielu reakcji wyzwalanych przez fotony.

Nasilenie retinopatii cukrzycowej, choroby oczu związanej z cukrzycą, wiąże się z obniżonym poziomem RBP3 i prowadzi do postępującej utraty wzroku. Ponieważ RBP3 oddziałuje z receptorami, takimi jak transporter glukozy 1 (GLUT1) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), jest zaangażowane we wzrost naczyń krwionośnych i sygnalizację komórkową w oku. Zaburzenie funkcjonowania RBP3 powoduje gromadzenie się „produktów odpadowych” siatkówki, takich jak lipofuscyna, która może powodować oksydacyjne uszkodzenie RPE oraz komórek fotoreceptorów. Oprócz retinopatii cukrzycowej, zaburzenia poziomu RBP3 mogą również prowadzić do barwnikowego zapalenia siatkówki, zwyrodnienia siatkówki i krótkowzroczności.

Chociaż związek RBP3 z tymi chorobami jest dobrze znany, mechanizmy wiązania się z retinoidami, w celu ich transportu wciąż nie są szczegółowo opisane. Tajemnica ta zaintrygowała międzynarodowy zespół badaczy pod kierownictwem dr Humberto Fernandesa z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk - Międzynarodowego Centrum Badań Oka (ICTER). Naukowcy skoncentrowali swoją uwagę na szczegółowym poznaniu struktury RBP3, gdyż wiąże ona różne retinoidy i kwasy tłuszczowe. Głównym celem ich badań było przezwyciężenie braku eksperymentalnego modelu strukturalnego dla natywnej formy RBP3. Aby osiągnąć cel, autorzy oczyścili cząsteczkę RBP3 (pRBP3) pozyskaną ze świńskiej gałki ocznej i przeanalizowali jej strukturę za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryoEM). Dane zostały zebrane  w warunkach kriogenicznych , a następnie udoskonalone za pomocą szczegółowych pomiarów i oprogramowania, co pozwoliło uzyskać ostateczną strukturę 3D białka. Dodatkowo wykorzystano rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), w celu zgromadzenia danych na temat zmian konformacji w zależności od ładunku cząsteczki. Co ciekawe, w wyniku badań naukowcy odkryli, że struktura RBP3 może być wydłużona lub wygięta, co sugeruje dynamiczne zmiany w strukturze podczas dokowania molekuły niosącej ładunek.

"Opierając się na wcześniejszej wiedzy na temat właściwości białka RBP3 i prostych metodach izolacji świńskiego wariantu RBP3, oczyściliśmy świńskie RBP3 i uzyskaliśmy białko z zachowaniem transferu energii rezonansu Förstera analogicznym do innych RBP3. Poprzez analizę danych krioEM określiliśmy strukturę białka RBP3 świni w rozdzielczości 3,67 Å i zaobserwowaliśmy zmiany konformacyjne po związaniu ligandu". - mówi dr Humberto Fernandes

Wyniki eksperymentalne umożliwiły określenie struktury 3D i ujawniły zmiany konformacyjne po związaniu z ligandem, co stanowi krok naprzód w zrozumieniu mechanizmów funkcjonalnych RBP3 podczas procesu widzenia.

RBP3 jako duża cząsteczka składająca się z czterech modułów wiążących retinoidy dawno utraciła swoją pierwotną funkcjonalność katalityczną i ewoluowała jako transporter ładunku oddziałujący z różnymi cząsteczkami oraz dostarczający retinoidy i kwasy tłuszczowe do oka.

Wyniki badań pokazują, że białko zmienia swój kształt podczas wiązania różnych cząsteczek, co związane jest z efektywnością interakcji z innymi cząsteczkami. W rezultacie zmiany konformacyjne mogą odgrywać znaczącą rolę w regulacji konwersji światła na obraz.

Dr Fernandes zauważa: "We wszystkich mierzonych parametrach wariant świński naśladuje lepiej scharakteryzowany wariant bydlęcy. Zdolność RBP3 do przyłączania różnych retinoidów i kwasów tłuszczowych, zdolność tych ostatnich do wypierania tych pierwszych oraz zmiany konformacyjne zależne od rodzaju ligandu mogą być podstawą  do wiązania retinoidów (i potencjalnie DHA) do określonych typów komórek graniczących z przestrzenią międzykomórkową IPM. Dlatego kompleksy RBP3 warte są dalszego badania".

Zrozumienie struktury białek, w tym mutacji genetycznych wpływających na zachowanie białek, takich jak badane RBP3, jest kluczowe dla opisania mechanizmów procesów zachodzących w chorobach siatkówki. Ujawnienie szczegółowej struktury tej bioaktywnej cząsteczki jest kamieniem milowym w badaniach nad interakcjami z różnymi białkami. Przedstawione odkrycia rzucają jasne światło na potencjalnie skuteczniejszą i szybszą diagnostykę, w której cząsteczka RBP3 będzie działać jako biomarker wczesnego stadium rozwoju choroby siatkówki. Co więcej, może to pomóc w regulacji aktywności RBP3, w celu opracowania metod leczenia zaburzeń procesu widzenia.

Praca została zrealizowana przy wsparciu finansowym Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanym ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Inteligentnej Gospodarki (FENG.02.01-IP.05-T005/23) oraz projektu (MAB/2019/12) w ramach programu Międzynarodowe Agendy Badawcze Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. Projekt był również wspierany przez National Institutes of Health R01EY009339. Autorzy dziękują również za wsparcie Department of Ophthalmology Gavin Herbert Eye Institute na University of California, Irvine z nagrody Research to Prevent Blindness, z NIH core grant P30EY034070, wsparcie MEYS CR (LM2023042) i Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego - projekt „Innowacja czeskiej infrastruktury dla zintegrowanej biologii strukturalnej” (No. CZ.02.01.01/00/23_015/0008175) i iNEXT-Discovery, numer projektu 871037, finansowany przez program Komisji Europejskiej Horyzont 2020, program stypendiów podoktorskich PASIFIC (umowa nr PAN.BFB.S.BDN.315 .022.2022; Projekt nr DPE/2023/00007), projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu badań i innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej Marii Skłodowskiej-Curie nr 847639 oraz z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego, a także szkolenia cryoEM w ramach programu szkoleniowego cryoEM finansowanego przez Wellcome/MRC (218785/Z/19/Z).

KONTAKT:

Dr. Humberto Fernandes
Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
International Centre for Translational Eye Research (ICTER)
email: hfernandes@ichf.edu.pl

SCIENTIFIC PAPERS:

“CryoEM structure and small-angle X-ray scattering analyses of porcine retinol-binding protein 3”
Vineeta Kaushik, Luca Gessa, Nelam Kumar, Matyáš Pinkas, Mariusz Czarnocki-Cieciura, Krzysztof Palczewski, Jiří Nováček, Humberto Fernandes
Open Biology, 2025
DOI: https://doi.org/10.1098/rsob.240180