Krwawe powiązania

Angiogeneza jest fizjologicznym procesem tworzenia sieci naczyniowych. Jego złożoność sprawia, że hodowla naczyń krwionośnych w warunkach laboratoryjnych pozostaje ogromnym wyzwaniem dla bioinżynierów. Na całym świecie prowadzone są intensywne badania mające na celu wykorzystanie nowego rodzaju biomateriałów do pobudzenia lub ukierunkowania wzrostu naczyń krwionośnych in vitro. Nowe modele tkankowe mogłyby pomóc w zrozumieniu mechanizmów i rozwoju nowych terapii np. chorób naczyniowych. W niedawnej publikacji, naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk zademonstrowali badania łączące inżynierię tkankową naczyń krwionośnych z metodami obliczeniowymi pozwalające na lepsze zrozumienie i kontrolowania angiogenezy w warunkach laboratoryjnych.

Angiogeneza jest złożonym procesem, który obejmuje tworzenie nowych naczyń krwionośnych poprzez podział i wzrost naczyń już istniejących. Jest on jednym z najistotniejszych procesów odpowiedzialnych za regenerację tkanek i może zachodzić w każdej części ciała. Jest jednak na tyle złożony, że jego kontrola lub naśladowanie w warunkach laboratoryjnych stało się jednym z głównych wyzwań bioinżynierii. Pełne zrozumienie i kontrolowanie tworzenia sieci naczyniowych mogłoby pomóc w leczeniu wielu chorób, od regeneracji naczyń krwionośnych uszkodzonych w wyniku urazu po leczenie nowotworów, czyniąc kontrolowaną angiogenezę swoistym „Świętym Graalem” medycyny regeneracyjnej.

Podążając tym tropem, naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) przeprowadzili serię eksperymentów mających na celu zbadanie ewolucji wzrastających sieci naczyń włosowatych. Badania przeprowadzono przy użyciu żeli fibrynowych jako materiału naśladującego tkanki miękkie i podtrzymującego naczynia. Na podstawie obserwacji różnych cech geometrycznych utworzonych sieci ustalono podstawowe prawa rządzące początkowym etapem angiogenezy.

Dotychczasowe badania ewolucji wzrastających sieci mikronaczyniowych były w dużej mierze oparte na analizie pojedynczych punktów czasowych w hodowli. Chociaż podejście to było wystarczające do oszacowania ogólnych trendów wzrostu, nie pozwalało na rozszyfrowanie poszczególnych etapów ewolucji mikroskopijnych naczyń krwionośnych in vitro stanowiąc poważne wyzwanie dla naukowców. Aby odkryć możliwe zasady rządzące dynamiką angiogenezy, zaproponowano szereg modeli teoretycznych na różnych poziomach złożoności. Niestety, bezpośrednie porównanie przewidywań teoretycznych z eksperymentami było ograniczone ze względu na niedobór czasowo-rozdzielczych danych eksperymentalnych, stąd większość badań teoretycznych opierała się jedynie na porównaniach jakościowych dla pojedynczych punktów w czasie.

Problem udało się rozwiązać zespołowi naukowców z IChF PAN i ich współpracownikom z Instytutu Fizyki Teoretycznej Uniwersytetu Warszawskiego, którzy za pomocą nowych eksperymentów i niestandardowych narzędzi do automatycznej analizy obrazu zademonstrowali możliwość systematycznego monitorowania sieci mikronaczyniowych zbierając duże ilości danych o poszczególnych gałęziach sieci pozwalając szczegółowe analizy statystyczne. Jednym z celów projektu było opracowanie nowych metod umożliwiających wiarygodne i powtarzalne testowanie wpływu leków na angiogenezę, a także opracowanie nowych strategii inżynierii mikrotkanek naczyniowych.

Jak zatem wygląda hodowla naczyń krwionośnych w laboratorium? Naukowcy użyli komórek śródbłonka, które, po dostarczeniu im niezbędnych składników odżywczych, w tym czynnika wzrostu, w sposób spontaniczny agregują w rozgałęzione mikrostruktury, tj. sieci mikronaczyniowe. Badacze monitorowali wzrost wielokomórkowych struktur dzień po dniu przez 14 dni w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, m.in. przy stałym poziomie dwutlenku węgla, wilgotności i temperatury (37oC). Komórki wydzielały przy tym fluorescencyjne białko pozwalając precyzyjnie śledzić ich wzrost pod mikroskopem. Przy użyciu tzw. mikroskopii konfokalnej, w połączeniu z automatyczną analizą obrazów, naukowcy zarejestrowali szereg parametrów morfometrycznych wzrastających sieci. Następnie, na podstawie dziesiątek obrazów mikroskopowych zebranych z wielu równoległych eksperymentów, przeprowadzone zostały dogłębne analizy statystyczne. Zbadano ewolucję całkowitej długości naczyń oraz ich powierzchni, jak również rozkłady statystyczne długości poszczególnych gałęzi lub kątów rozgałęzień  koncentrując się na ich dynamice zmian w czasie. Celem było zwłaszcza zrozumienie złożoności wczesnych etapów angiogenezy, obejmujących tworzenie tzw. „kiełków” i ich rozwidleń, wydłużanie gałęzi, a następnie tworzenie pierwszych wzajemnych połączeń.

Wg. Dr Katarzyny Rojek, pierwszego autora pracy, badania zaprezentowane przez zespół pozostają wyjątkowe ze względu na zaproponowane nowe podejście eksperymentalne: "Dzięki zabraniu dużej ilości danych biologicznych z niezależnie „kiełkujących” mikrosieci udało nam się wykonać istotny krok w kierunku zrozumienia powstawania i ewolucji kiełkujących sieci naczyniowych. Do tej pory większość zasad wzrostu sieci wyprowadzana była z modeli matematycznych, które—choć stanowią bardzo potężne narzędzie—często prowadzą do błędnych wniosków z powodu nadmiernych uproszczeń. Warto podkreślić, jak ważna w naszym projekcie była ścisła współpraca między biologami i fizykami.”

Autorzy badania opracowali również nowe protokoły analizy obrazów, które pozwoliły na określenie wyżej wymienionych parametrów w sposób zautomatyzowany. "Napisaliśmy nasze oprogramowanie języku Python, optymalizując je pod kątem przetwarzania dużej ilości danych z wielu eksperymentów. Zapewniliśmy w ten sposób solidne podstawy pod względem implementacji gwarantując krótki czas obliczeń. Dane czasowo-rozdzielcze obejmowały cały okres życia sieci co pozwoliło nam zaproponować podstawowe zasady rządzące rozwojem wzrastających mikronaczyń" - dodają prof. Piotr Szymczak oraz Antonii Wrzos, odpowiedzialni za rozwój oprogramowania do analizy danych.

Naukowcy prowadzili obserwacje mikroskopowe dzień po dniu, śledząc ewolucję sieci naczyniowych przy użyciu autorskiego oprogramowania. Ustalono, że wzrost naczyń podzielić można na 3 etapy: (i) początkowy etap nieaktywny, w którym komórki rozmnażały się bez tworzenia „kiełków”, (ii) etap szybkiego „kiełkowania”, w którym naczynia wydłużały się i rozgałęziały, oraz (iii) końcowy etap dojrzewania, w którym tempo wzrostu spowalniało. Analizy dostarczyły również danych na temat różnic wzrostu naczyń w różnych pożywkach, wskazując na wpływ dodanego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego na zachowanie hodowanych komórek. Najważniejszym efektem „wzbogaconej” pożywki było wcześniejsze rozpoczęcie „kiełkowania” i zwiększenie liczby końcowych rozgałęzień, podczas gdy liniowe tempo wzrostu ‘kiełków’ pozostawało niezmienne. Szczegółowa analiza morfometryczna przeprowadzona przez zespół wykazała dodatkowo, że kąty pomiędzy poszczególnymi rozgałęzieniami oscylują wokół średniej wartości, bliskiej „magicznej” wartości 72 stopni charakterystycznej dla tzw. modeli wzrostu Laplace’a. Analogia ta sugeruje, że - podobnie jak w tzw. wzroście laplasjańskim – wzrastające naczynia mają tendencję do podążania za lokalnymi gradientami stężenia czynnika wzrostu.

"Podsumowując, nasze wyniki, ze względu na ich wysoką istotność statystyczną, mogą służyć np. jako punkt odniesienia dla modeli matematycznych. Przyszłe badania mogą potencjalnie zapewnić lepsze zrozumienie w jaki sposób zewnętrzne sygnały wpływają na unaczynienie biomateriałów i pomóc w optymalizacji strategii naprawy tkanek i gojenia ran, np. poprzez odpowiednie zaprojektowanie wstępnie unaczynionych opatrunków". - zauważa dr Guzowski.

W swojej pracy naukowcy dostarczyli zatem wyników, które mogą być przydatne w zrozumieniu angiogenezy in vitro i zastosowane np. w inżynierii tkankowej, jak również w testowaniu leków. Zaprezentowane wyniki są krokiem w kierunku szybszego i bardziej efektywnego rozwoju spersonalizowanych terapii, w których testy wykonywane mogłyby być na komórkach od pacjenta. W oparciu o analizy numeryczne, proponowane badania mają również potencjał do usprawnienia procesu badań przesiewowych w przemyśle farmaceutycznym. Autorzy wskazują na znaczenie rozwoju bibliotek danych jako jednego z najważniejszych kroków w identyfikacji potencjalnie skutecznych związków, a także w przyszłych zastosowaniach w bioinżynierii. Oprócz naukowego aspektu przedstawionych badań, autorzy podkreślają znaczenie interdyscyplinarności w badaniach, nie tylko  tych związanych z  bioinżynierią i modelowaniem mikrotkanek.

Praca została zrealizowana przy wsparciu grantów Sonatina (grant nr 2020/36/C/NZ1/00238 przyznany K.O.R.) i Opus (grant nr 2022/45/B/ST8/03675 przyznany J.G.) Narodowego Centrum Nauki (NCN), programu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego PMW w latach 2020-2024 nr 5005/H2020-MSCA-COFUND/2019/2 oraz z programu badań naukowych i innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 w ramach grantu Marii Skłodowskiej-Curie nr 847413.

KONTAKT:

Dr Jan Guzowski
Instytut Chemii Fizycznej, Polska Akademia Nauk
Telefon : +48 22 343 3406
e-mail: jguzowski@ichf.edu.pl

ARTYKUŁ:

"Long-term day-by-day tracking of microvascular networks sprouting in fibrin gels: From detailed morphological analyses to general growth rules"
Katarzyna O. Rojek, Antoni Wrzos, Stanisław Żukowski, Michał Bogdan, Maciej Lisicki, Piotr Szymczak, Jan Guzowski
APL Bioengineering, 2024, 016106
https://doi.org/10.1063/5.0180703