Licz do trzech – zmierz CRP

Stan zapalny jest naturalną odpowiedzią immunologiczną organizmu na chorobę lub infekcję. Zwiększa on przepływ krwi w organizmie i pomaga komórkom organizmu bronić się przed wirusami, infekcjami lub uszkodzeniem komórek. Skuteczne leczenie jest ściśle powiązane z szybką diagnostyką stanu zapalnego, dlatego niezwykle ważne jest badanie poziomu określonych biomarkerów w organizmie. Niedawno naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk zaprezentowali nowatorskie urządzenie do monitorowania poziomu białka C-reaktywnego (CRP), które jest wytwarzane w organizmie podczas stanu zapalnego. Przyjrzyjmy się bliżej Ich badaniom.

Białko C-reaktywne (CRP) to cząsteczka będącą ważnym czynnikiem zaostrzającym wiele chorób o różnej etiologii. Chociaż CRP jest znane i stosowane do rozpoznania stanu zapalnego od wielu dekad, to jego zastosowanie jako potencjalnego biomarkera w diagnostyce innych stanów chorobowych w organizmie jest stosunkowo nowe. CRP jest białkiem osocza wytwarzanym w wątrobie i uwalnianym do krwiobiegu w odpowiedzi układu odpornościowego, działając jako biomarker stanu zapalnego oraz infekcji.

Monitorowanie jego poziomu pomaga zdiagnozować nawet ciężkie stany, takie jak posocznica, martwica niedokrwienna i/lub nawet nowotwory złośliwe. Ponieważ jest ono klasyfikowane, jako czynnik tzw. ostrej fazy, pojedynczy pomiar poziomu CRP wskazuje jedynie na choroby zapalne, a badania krwi muszą być często powtarzane w celu określenia skuteczności określonej terapii. Obecnie, pomimo postępu technologicznego w biomedycynie i diagnostyce medycznej, techniki stosowane do monitorowania poziomu CRP są nadal dalekie od pomiarów prowadzonych w czasie rzeczywistym.

Niedawno naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) kierowani przez prof. Martina Jönssona-Niedziółkę zaprezentowali nowatorskie narzędzie diagnostyczne do precyzyjnego pomiaru poziomu CRP. Co więcej, naukowcy przedstawiają możliwość prowadzenia analiz w czasie rzeczywistym, znacząco skracając czas i koszty badań. Proponowane rozwiązanie opiera się na podłączonym do smartfona urządzeniu umożliwiając jego zastosowanie w dowolnym miejscu np. bezpośrednio przy pacjencie (POCT – z ang. point-of-care testing). Samo urządzenie jest wielkości karty kredytowej, wyposażone w biosensory elektrochemiczne połączone z technologią komunikacji bliskiego zasięgu, a wszystko jest umieszczone w niewielkim urządzeniu mikroprzepływowym.

W przeciwieństwie do już opracowanych biosensorów, które wykorzystują duże przeciwciała IgG do wychwytywania istotnych biomarkerów stanu zapalnego, proponowane przez badaczy z IChF PAN urządzenie POCT oferuje wyższą czułość i stabilność, a przede wszystkim pomiary w czasie rzeczywistym, znacznie zwiększając potencjalne zastosowanie w diagnostyce CRP. Urządzenie wyposażone w biosensor może wychwytywać i oznaczać ilościowo CRP ze skutecznością podobną do klasycznych i kosztownych testów np. ELISA. Pomiary są wykonywane elektrochemicznie przy użyciu dostępnego na rynku, przenośnego potencjostatu, podczas gdy wychwytywanie CRP odbywa się na unikalnej elektrodzie wbudowanej w wąskie kanały urządzenia mikroprzepływowego. System wykorzystuje również technologię komunikacji bliskiego zasięgu (NFC – z ang. near-field communication) umożliwiającą bezprzewodową wymianę danych między elektrodami a urządzeniami mobilnymi. Wyniki pomiaru mogą być wyświetlane na smartfonach z systemem Android, zapewniając użytkownikom skuteczny sposób gromadzenia i analizowania danych zmierzonych elektrochemicznie w czasie rzeczywistym.

Jak to działa? Próbka płynu jest umieszczana na małej płytce urządzenia mikroprzepływowego, która jest wyposażona w małą elektrodę. Poprzez drobne kanaliki w urządzeniu, próbka podawana jest stopniowo do kolejnych części urządzenia wraz z dodatkowym roztworem zaledwie za pomocą sił kapilarnych bez konieczności stosowania zewnętrznej pompy, co umożliwia automatyczny przepływ sekwencyjny. Kluczową rolę w zaprezentowanym urządzeniu odgrywają nanociała anty-CRP unieruchomione na elektrodzie. Nanociała to małe fragmenty przeciwciał, które stanowią alternatywę dla konwencjonalnych przeciwciał stosowanych do ilościowego oznaczania CRP. Ze względu na niewielki rozmiar, większą odporność na degradację w porównaniu z przeciwciałami, nanociała uzyskane metodą tzw. phage display mogą być stosowane w różnych warunkach eksperymentalnych, osiągając wysoką specyficzność wiązania antygenu.

"Aby unieruchomić nanociała anty-CRP na elektrodzie, zmodyfikowano hydroksylowe grupy funkcyjne obecne na utlenionej elektrodzie w celu otrzymania grup aldehydowych w reakcji utleniania. Następnie, nanociała te  zostały unieruchomione na utlenionej elektrodzie za pomocą wiązania iminowego (C═N). W ten sposób uzyskaliśmy elektrodę o wysokim specyficznym powinowactwie do antygenu". - mówi dr Suchanat Boonkaew, pierwszy autor prezentowanej pracy.

Wysoki stopień pokrycia elektrody nanociałami ze względu na ich niewielki rozmiar poprawia czułość pomiaru elektrochemicznego nawet w zakresie bardzo niskich stężeń. Zapewnia to balans pomiędzy dokładnością analityczną w fizjologicznie istotnym zakresie stężeń a czasem analizy.

Dr Katarzyna Szot-Karpińska dodaje: "Aby wyprodukować elektrodę modyfikowaną nanociałami, oparliśmy się na naszym doświadczeniu w tzw. biopanningu w celu odzyskania nowych nanociał specyficznych dla CRP, które zostaną wykorzystane jako materiał aktywny w wytworzonym przez nas biosensorze".

Selektywność proponowanego biosensora opartego na nanociałach została przetestowana w różnych mediach, zakłócając pomiary obecnością związków biologicznie czynnych, takich jak interleukina-6, fibrynogen, mioglobina, albumina surowicy bydlęcej i albumina surowicy ludzkiej, a także eksponując urządzenie na różne warunki eksperymentalne, w tym zmiany temperatury i wilgotności.

Prof. Martin Jönsson-Niedziółka zauważa: "Zaproponowana metoda została zastosowana do wykrywania CRP w pełnej krwi ludzkiej uzyskanej od anonimowych dawców. Wyniki eksperymentów wykazały, że system oparty na NFC zintegrowany z przepływowym urządzeniem mikroprzepływowym może prawidłowo oznaczać CRP w istotnych klinicznie próbkach biologicznych bez konieczności stosowania dodatkowych procedur wstępnych, a zatem może być stosowany do oceny stanu zapalnego, infekcji wywołanych przez bakterie lub wirusy oraz monitorowania zwiększonego ryzyka chorób serca".

Prędzej czy później każdy zmaga się ze stanem zapalnym. Niezależnie od jego etiologii, szybka i selektywna diagnostyka umożliwiająca monitorowanie skuteczności leczenia w czasie rzeczywistym jest wciąż daleka od ideału. Dlatego, możliwość wykorzystania szybkich i przenośnych urządzeń do badania w punktach opieki bez wątpienia zrewolucjonizowałoby wiele sektorów diagnostyki medycznej, ułatwiając życie wielu pacjentom. Urządzenie zademonstrowane przez naukowców z IChF PAN to niezawodne i ekonomiczne rozwiązanie diagnostyczne oferujące przyjazną dla użytkownika obsługę i szybkie uzyskanie wyników w ciągu zaledwie kilku minut bez wychodzenia z domu. Zapewnia ono również powtarzalność zarówno w produkcji biosensorów, jak i wykrywaniu CRP, stając się krokiem w kierunku nowoczesnej i spersonalizowanej opieki zdrowotnej. Elektrody oparte o nanociała umożliwiają przeprowadzanie wielu analiz w czasie rzeczywistym, przyspieszając diagnostykę i ocenę skuteczności leczenia, dzięki czemu możliwe jest natychmiastowe podejmowanie decyzji co do leczenia pacjenta i szybkie poprawienie rezultatów terapii.

Badania opublikowane w ACS Sensors zostały wsparte przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (NCBR) w ramach funduszy EEA i funduszy norweskich (numer projektu: NOR/POLNOR/UPTURN/0060/2019) oraz przez grant CRP 20/026 ufundowany przez ICGEB i Narodowe Centrum Nauki Polska w ramach grantu SONATA 13 UMO-2017/26/D/ST5/00980. Autorzy składają podziękowania dla Narodowego Muzeum Techniki za możliwość wykonania zdjęć z wykorzystaniem rekwizytów muzealnych.

KONTAKT:

Prof. Martin Jönsson-Niedziółka
Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Tel: +48 22 343 3406
e-mail: martinj@ichf.edu.pl

ARTYKUŁ:

" NFC Smartphone-Based Electrochemical Microfluidic Device Integrated with Nanobody Recognition for C-Reactive Protein”
Suchanat Boonkaew,  Katarzyna Szot-Karpińska, Joanna Niedziółka-Jönsson, Ario de Marco,  Martin Jönsson-Niedziółka
ACS Sens. 2024, 9, 6, 3066–307
https://doi.org/10.1021/acssensors.4c00249